6.L01-B1可能改變?nèi)祟惸c道微生物群的組成
由于多糖是塑造腸道微生物群組成的關(guān)鍵因素，我們隨后研究了L01-B1對(duì)人類腸道微生物群進(jìn)行了16S rRNA基因多樣性測序。
對(duì)于α多樣性，在ASV水平上，對(duì)照組和L01-B1組的Ace和Chao指數(shù)均無顯著差異（p>0.05）（圖5b和c）。對(duì)于β多樣性，在ASV水平上，主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維標(biāo)度（NMDS）顯示兩組間無顯著差異（圖5d–f）。我們進(jìn)行了中性群落模型（NCM）分析，結(jié)果表明，補(bǔ)充L01-B1后群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化（圖5g）。韋恩圖分析顯示，與對(duì)照組相比，L01-B1組的物種數(shù)量減少（圖5h）。
在門水平上，腸道微生物群的組成發(fā)生變化，與對(duì)照組相比，變形菌門和擬桿菌門的豐度降低，而放線菌門的豐度增加（圖5i）。基于前50個(gè)物種的豐度，熱圖分析顯示，與對(duì)照組相比，費(fèi)氏大腸桿菌（Escherichia fergusonii）的豐度顯著降低（圖5j）。有趣的是，補(bǔ)充L01-B1后，長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）的豐度增加（圖5j）。在物種水平上，我們進(jìn)一步對(duì)兩組進(jìn)行了比較分析和LEfSe分析，結(jié)果表明，費(fèi)氏大腸桿菌在對(duì)照組中富集，而長雙歧桿菌在L01-B1組中富集（圖5k和l）。綜合來看，L01-B1可能改變?nèi)祟惸c道微生物群的組成，并可能增加長雙歧桿菌的豐度。
圖5.基于16S rRNA基因的多樣性測序顯示，L01-B1可改變?nèi)祟惸c道微生物群的組成。（a）體外實(shí)驗(yàn)的示意圖。（b）ASV水平上的α多樣性分析，Ace指數(shù)。（c）ASV水平上的α多樣性分析，Chao指數(shù)。箱線圖顯示了最小值、最大值、中心、箱體邊界、須狀線以及百分位數(shù)。（d）ASV水平上的主坐標(biāo)分析（PCoA）。（e）ASV水平上的非度量多維標(biāo)度（NMDS）分析。（f）ASV水平上的NMDS分析。（g）中性群落模型（NCM）分析。（h）物種水平上的韋恩圖分析。（i）柱狀圖顯示的門水平上腸道微生物群的組成分析。（j）熱圖顯示的物種水平上腸道微生物群的組成分析。（k）對(duì)照組和L01-B1組在物種水平上的比較。（l）物種水平上的LEfSe分析。
7.L01-B1在體外富集長雙歧桿菌
為了驗(yàn)證長雙歧桿菌的豐度，根據(jù)熱圖結(jié)果從每組中選取了四個(gè)樣本進(jìn)行宏基因組測序（圖5j）。在物種水平上，α多樣性和β多樣性分析的結(jié)果均存在顯著差異（p<0.05）（圖S10a–d）。這些發(fā)現(xiàn)表明，L01-B1改變了腸道微生物群的結(jié)構(gòu)。通過門水平的柱狀圖顯示，腸道微生物群的組成發(fā)生了顯著變化。分析結(jié)果顯示，擬桿菌門的豐度大幅下降，而放線菌門的豐度顯著增加（圖6a）。在物種水平上，熱圖結(jié)果表明，長雙歧桿菌的豐度顯著增加（圖6b，c）。
我們隨后對(duì)兩組進(jìn)行了比較分析和LEfSe分析。與多樣性測序的結(jié)果一致，長雙歧桿菌顯著富集（圖6d，e）。綜上所述，我們得出結(jié)論，L01-B1顯著增加了長雙歧桿菌的豐度，而對(duì)擬桿菌屬細(xì)菌則可能不那么友好。
圖6.宏基因組測序顯示，L01-B1增加了長雙歧桿菌的豐度。（a）在門水平上分析了人類腸道微生物群的組成。（b）在物種水平上分析了人類腸道微生物群的組成。（c）分析了長雙歧桿菌的相對(duì)豐度。（d）兩組在物種水平上的比較。（e）物種水平上的LEfSe分析。數(shù)據(jù)代表技術(shù)重復(fù)三次（n=4）。對(duì)于兩組之間的比較，采用非配對(duì)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。
8.從人糞便中分離出長雙歧桿菌亞種sueorum
為了進(jìn)一步探討這一現(xiàn)象，我們嘗試從人糞便中分離出長雙歧桿菌。正如預(yù)期，菌落在37°C無氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后在mMRS平板上生長良好（圖7a）。16S rRNA測序及比對(duì)結(jié)果顯示，分離出的菌株為長雙歧桿菌亞種sueorum，并命名為DK001（圖S11）。生化鑒定表明，DK001能夠發(fā)酵棉子糖、乳糖、D-核糖和淀粉，但不能發(fā)酵葡萄糖酸、三梨醇、纖維二糖、山梨醇或D-阿拉伯糖（表S6）。透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果顯示，該菌株無莢膜，呈卵圓形（圖7b）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，DK001與從中國分離的長雙歧桿菌亞種sueorum具有較高的同源性（圖7c）。因此，本研究成功分離并鑒定了長雙歧桿菌的一個(gè)亞種。
圖7.細(xì)菌分離與鑒定。（a）使用添加50 mg/L莫匹羅星的mMRS平板進(jìn)行細(xì)菌分離。（b）通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察DK001的形態(tài)特征。（c）利用MEGA 11.0軟件對(duì)DK001菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。
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