2、結(jié)果與討論
2.1植酸酶AppA靶向基因修飾系統(tǒng)構(gòu)建
為了實現(xiàn)pGSA-appA基因在目標(biāo)細(xì)菌基因組中16S rRNA基因位點的靶向修飾，需要對原始pSPIN載體骨架進行逐步改造。原始pSPIN的Spacer引導(dǎo)序列靶向定位于lacZ基因(圖2A)。第一步，將原始Spacer序列改造為針對目標(biāo)菌株的16s-spacer(該序列引導(dǎo)整個轉(zhuǎn)座復(fù)合體對靶點的識別)，見圖2B。第二步，以16s-pSPIN為基礎(chǔ)，對Cargo轉(zhuǎn)座子的啟動子進行改造。原始載體的Cargo基因缺少啟動子，因此采用組成型啟動子J23119，以實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達，改造后得到質(zhì)粒J23119-16s-pSPIN(圖2C)。隨后，在J23119-16s-pSPIN質(zhì)?；A(chǔ)上對Cargo轉(zhuǎn)座子區(qū)域進行改造，將pGSA-AppA融合蛋白基因酶切(圖3B)并連接在J23119啟動子后10 bp左右處，構(gòu)建最終的植酸酶AppA表面展示系統(tǒng)載體，使其能夠在16S rRNA基因位點上表達(圖2D)。
▲圖2 pGSA-appA-pSPIN載體的構(gòu)建流程
▲圖3轉(zhuǎn)座插入(A)和pGSA-appA載體構(gòu)建(B)的PCR凝膠圖譜。M1：DL2000 DNA marker；泳道1：土著菌；泳道2：基因修飾菌；3：pGSA-appA酶切驗證；4：pET-30a-pGSA的載體克隆驗證；M2：DL5000 DNA marker。
錨定蛋白pGSA是枯草芽孢桿菌的γ-谷氨酸合成酶A(poly-γ-glutamic synthetase A)膜蛋白，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的表面展示。該錨定蛋白具有表面展示效率高、使用方便等優(yōu)點，且表面展示后的蛋白具有更高的活性和環(huán)境耐受性。AppA植酸酶最初發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，由其基因組中的appA基因編碼，屬于組氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族。植酸酶AppA的三維結(jié)構(gòu)包含一個催化域(負(fù)責(zé)水解植酸)和一個結(jié)構(gòu)輔助域(增強了底物結(jié)合能力)，是一種典型的6-植酸酶(6-phytase)，即優(yōu)先從植酸的D-6位點開始水解磷酸酯鍵，依次生成IP5、IP4等低磷酸化肌醇衍生物，最終產(chǎn)物是無機磷酸和肌醇。
根據(jù)從黑土中分離的土著細(xì)菌皮氏羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)G3的16S rRNA基因序列特征，設(shè)計pGSA-appA-pSPIN的Spacer序列，用于pGSA-appA的基因修飾，靶向位點位于27F后962 bp處。INTEGRATE系統(tǒng)通過Spacer序列的引導(dǎo)，會將整個R end-L end的Cargo區(qū)域轉(zhuǎn)座至目標(biāo)位點。為了驗證轉(zhuǎn)座插入的成功，針對插入序列設(shè)計了特異性引物(27F/CM2R)，對嵌合16S rRNA基因的27F到R end之間的序列進行PCR，其中CM2R是R end上的特征序列。凝膠電泳結(jié)果顯示，由于外源基因已成功插入基因組的目標(biāo)位置形成融合基因，因此可以通過特異性引物完成PCR過程；而原始菌株由于缺乏Cargo轉(zhuǎn)座區(qū)，因此無R end段序列，進而無PCR產(chǎn)物(圖3A)。R.pickettii G3屬于革蘭氏陰性好氧菌，致病性較低，是環(huán)境中常見的一種細(xì)菌，能夠適應(yīng)復(fù)雜及惡劣環(huán)境，在許多環(huán)境污染修復(fù)方面表現(xiàn)出潛力，并且該菌可以通過共代謝的方式，與其他微生物互利共生，促進生長并提高環(huán)境修復(fù)效果。核糖體16S rRNA由細(xì)菌基因組上的基因序列轉(zhuǎn)錄而成，rrnDB數(shù)據(jù)庫顯示，Ralstonia通常含有3-4個16S rRNA基因拷貝，因此其冗余的16S rRNA基因可以作為基因修飾的位點。
INTEGRATE系統(tǒng)的PAM序列為“CC”，緊隨其后的是引導(dǎo)的Spacer序列。對PCR測序結(jié)果顯示，pGSA-appA的Cargo區(qū)域插入到Spacer序列后49 bp處(圖4)。通常Cargo區(qū)域會插入到靶點Spacer序列后50 bp左右處，這與本研究的結(jié)果一致。Klompe等研究結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)座子序列的兩端(L end和R end)交換位置后其轉(zhuǎn)座效率更高。因此，本研究采用“R end”在前的載體構(gòu)建方法(圖1)。
▲圖4 pGSA-appA的插入位點
基因修飾是通過在宿主細(xì)胞內(nèi)插入一段目的基因或刪除某段特定基因，從而使原有宿主獲得新的功能或改變其基因型。理想的基因修飾技術(shù)應(yīng)不依賴DNA斷裂及同源重組，同時具備特異性和可編程性?；贑RISPR技術(shù)的最新進展為微生物染色體的便捷整合提供了新的思路和方法。傳統(tǒng)的基因工程菌構(gòu)建通常使用模式菌株，或者具有特殊整合位點的菌株。最新研究表明，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以與細(xì)菌類Tn7轉(zhuǎn)座子結(jié)合，完成RNA引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座整合。隨著該技術(shù)的不斷改進，INTEGRATE編輯系統(tǒng)得以開發(fā)并初步應(yīng)用。該系統(tǒng)主要包括3個部分：目標(biāo)基因、TnsABC轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體以及Cas蛋白串，最終目標(biāo)基因在向?qū)NA的引導(dǎo)下，在目標(biāo)位點下游50 bp左右處完成整合。然而，將該技術(shù)應(yīng)用于黑土根際微生物菌群的功能基因修飾方面，目前仍處于空白狀態(tài)。目前，該系統(tǒng)的插入目標(biāo)位點主要為LacZ以及一些經(jīng)過篩選的安全位點，缺乏更便利的候選插入位點。本研究使用16S rRNA基因作為修飾基因的靶點，并驗證了該位點的可行性，從而實現(xiàn)了在任意菌株上快速的靶向轉(zhuǎn)座和基因修飾。值得注意的是，由于載體的轉(zhuǎn)化需要借助E.coli WM3064的結(jié)合轉(zhuǎn)移，因此該方法僅適用于革蘭氏陰性菌。此外，更為復(fù)雜的環(huán)境，例如土壤中的微生物菌群能否實現(xiàn)快速的基因整合，也是重要的研究方向。
2.2基因修飾菌的生長和植酸酶活性檢測
在生長曲線對比分析中發(fā)現(xiàn)，與未改造的原始菌相比，基因修飾菌在穩(wěn)定期的OD600吸光度略低，但二者較為接近(圖5A)。由于轉(zhuǎn)座的位置是核糖體的16S rRNA基因位點，核糖體主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成和加工，對其位置進行改造可能會導(dǎo)致細(xì)菌生長狀況的改變。然而，本研究結(jié)果表明，對冗余的16S rRNA基因進行嵌入不會明顯抑制或影響細(xì)菌的生長。
▲圖5基因修飾菌的生長趨勢對比及對植酸的水解。A：生長曲線對比；B：不同底物濃度的水解率；C：pH對植酸酶活性的影響。
隨后，檢測了植酸酶基因修飾菌在不同植酸濃度條件下的水解能力。結(jié)果顯示基因修飾菌表現(xiàn)出更高的水解能力(圖5B)，其水解植酸的能力是原始菌的8倍以上。由于原始菌擁有其他種類的磷酸酶，這些酶也會在一定程度上水解植酸，因此原始菌也表現(xiàn)出一定的植酸水解能力，但遠低于基因修飾菌。此外，在低濃度植酸條件下，基因修飾菌(OD600值為1.0)可以在1 h內(nèi)水解超過80%的植酸，并且其水解率會隨著底物濃度升高而降低。
pH對基因修飾菌植酸酶活性的影響如圖5C所示。隨著pH值的增加，酶活性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在pH 6.0時表現(xiàn)出最高的相對酶活性，隨后在堿性環(huán)境下酶活性會迅速下降，其相對酶活性在pH 8.0時僅為20%左右。植酸酶是一種酸性磷酸酶，因此堿性環(huán)境不利于植酸酶活性的維持，之前的研究結(jié)果也表明植酸酶在堿性環(huán)境中活性會迅速降低。
為了使植酸酶在基因修飾菌中穩(wěn)定表達，本研究使用了組成型的J23119啟動子。該啟動子可以不依賴誘導(dǎo)物而自行啟動下游基因的表達，并且其表達量適中，基本不會影響宿主的生長。目前，只有少數(shù)植酸酶成功展示在細(xì)胞表面，且常用模式生物作為宿主，例如酵母和枯草芽孢桿菌，并且其表面展示通常借助表達載體。雖然表達載體使用較為便捷，但其使用會導(dǎo)致一些潛在問題，例如持續(xù)的篩選壓力、抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移、載體丟失等，這使得其在使用過程中存在更高的風(fēng)險。本研究將整個植酸酶表面展示的融合蛋白轉(zhuǎn)座至細(xì)菌基因組，可以保證其穩(wěn)定表達，且由于該系統(tǒng)是無痕編輯，因此不存在抗生素抗性基因泄漏的風(fēng)險。
2.3土壤有機磷活化
在添加植酸酶基因修飾的R.pickettii G3菌后，處理組的土壤表現(xiàn)出更高的植酸酶活性，是對照土壤植酸酶活性的2倍以上。在第21天時，植酸酶活性緩慢下降，但其活性仍可長期保持，在28 d后其植酸酶活性依然保留1.5倍左右(圖6A)。土壤植酸酶活性結(jié)果顯示，植酸酶基因修飾菌株極大地提高了對土壤植酸的水解潛力。
▲圖6土壤植酸酶活性和有效磷含量變化。A：土壤植酸酶活性對比；B：土壤速效磷含量對比。
植酸酶會水解土壤中的植酸并釋放磷酸根，從而提高土壤速效磷含量。對土壤速效磷的檢測結(jié)果顯示，從第7天開始，土壤速效磷含量顯著提高，在第14天后達到最高水平，提高了近30%(圖6B)。由于大豆對土壤磷的攝取，土壤中磷含量會緩慢下降，但整體上基因修飾菌添加組的速效磷含量高于對照組。其他研究結(jié)果表明，提高土壤植酸酶活性可以顯著提高土壤速效磷水平，最高可提高54.48%的速效磷含量，并且這種促進效果可以維持較長時間。此外，其他研究也采用類似策略，通過添加外源植酸酶的方式，水解了土壤中近17.0%的植酸，并提高了22.5%的有效磷含量。目前，許多產(chǎn)植酸酶的根際菌被用于植物促生，接種促生菌后，根長、磷含量、生物量和產(chǎn)量均有顯著改善。然而，野生菌的遺傳調(diào)控通常難以控制，實際應(yīng)用可能會超出預(yù)期。
轉(zhuǎn)基因微生物在環(huán)境修復(fù)和藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因微生物的環(huán)境風(fēng)險可以得到有效控制和評估。CRISPR基因組編輯是一種典型的“無標(biāo)記”基因編輯技術(shù)，可避免抗性基因的潛在危害。此外，荷蘭的研究團隊進行了30多年的觀察，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌有明顯的環(huán)境影響，表明它們是可以安全使用的。
3、結(jié)論
目前，已報道的CRISPR引導(dǎo)轉(zhuǎn)座研究中均缺乏通用的基因轉(zhuǎn)座位點。許多細(xì)菌基因是單拷貝基因，并且由于環(huán)境中的細(xì)菌通常為營養(yǎng)缺陷型，許多細(xì)菌并不一定擁有已報道的轉(zhuǎn)座靶位點，例如LacZ基因，這無疑限制了INTEGRATE等CRISPR轉(zhuǎn)座技術(shù)的應(yīng)用。本研究基于CRISPR引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座插入技術(shù)，創(chuàng)造性地將目標(biāo)菌的16S rRNA基因位點作為靶點，進行快速基因修飾。16S rRNA基因位點作為轉(zhuǎn)座靶點，一方面省去了復(fù)雜的安全位點篩選，同時由于其為多拷貝基因，因此在基因組中部分16S rRNA基因位點的轉(zhuǎn)座并不會對轉(zhuǎn)基因菌的生長造成影響。此外，通過實驗證明，功能基因可以快速完成靶向轉(zhuǎn)座，其位置可以通過Spacer序列進行精確定位。此外，細(xì)胞分裂基因也是微生物所共有的基因之一，同樣可以作為基因修飾的候選靶點。
完成外來基因在目標(biāo)細(xì)菌基因組上的整合后，其功能能否發(fā)揮是另一個重要的研究內(nèi)容。本研究使用組成型啟動子J23119，可保證目的基因在土壤環(huán)境中的穩(wěn)定表達。結(jié)果顯示，經(jīng)過植酸酶基因修飾的土著菌獲得了極高的植酸酶活性，并且其功能具有較寬的pH譜。將基因修飾菌施用于黑土后，土壤植酸酶活性提高了2倍左右，土壤速效磷含量也顯著提高。因此，通過CRISPR轉(zhuǎn)座介導(dǎo)的基因修飾可以賦予土著菌新的功能。植酸酶活性的提高可以有效活化土壤有機磷庫，釋放速效磷。通過基因修飾的微生物策略對于黑土等土壤的元素活化具有一定的潛力和研究價值。
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