摘要
磷是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，然而植物從土壤中可獲取的磷素十分有限，土壤中存在大量難利用的有機(jī)難降解磷，其中植酸(肌醇六磷酸)占據(jù)了較大部分。
目的利用植酸酶對(duì)植酸的高效水解能力，對(duì)黑土土著細(xì)菌進(jìn)行植酸酶基因修飾，提高土壤有效磷含量。
方法利用錨定蛋白pGSA對(duì)細(xì)菌植酸酶AppA進(jìn)行表面展示，以提高蛋白酶的穩(wěn)定性和活性以及底物的接觸效率?；贑RISPR靶向基因插入修飾技術(shù)，將表面展示的植酸酶融合蛋白基因靶向轉(zhuǎn)座至一株從黑土分離的皮氏羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)G3的基因組16S rRNA基因位點(diǎn)，以擺脫傳統(tǒng)蛋白表達(dá)的載體依賴。
結(jié)果細(xì)菌16S rRNA基因可以作為基因修飾的通用靶點(diǎn)，并且不會(huì)對(duì)該菌的增殖產(chǎn)生明顯影響。植酸酶基因修飾菌對(duì)植酸的水解能力提高了8倍以上，并且可以在較寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用。將該基因修飾菌施用于黑土后，土壤植酸酶活性明顯提升，且速效磷含量提高了近30%。
結(jié)論植酸酶基因修飾的土著細(xì)菌能夠促進(jìn)土壤植酸水解，增加土壤有效磷含量，提高土壤磷素有效性。
土壤中生物可直接利用的磷通常較少，大部分磷以有機(jī)磷的形式存在(20%-80%)。低分子量磷酸單酯(如植酸、磷酸糖和核糖核苷酸)以及磷酸酯聚合物(如核酸和磷脂)，是土壤中有機(jī)磷的主要形式，其主要源于植物和微生物殘?bào)w。黑土中，有機(jī)磷的占比通常在20%-60%之間，高有機(jī)質(zhì)土壤中的有機(jī)磷含量甚至可占土壤總磷的50%以上，而植酸是有機(jī)磷的重要組成部分。植酸(肌醇六磷酸)是一種廣泛存在于植物中的有機(jī)磷化合物，農(nóng)田土壤中的植酸主要來源于植物殘?bào)w分解、根系分泌物、有機(jī)肥以及微生物活動(dòng)，其中植物殘?bào)w和有機(jī)肥輸入占比較高。在耕地土壤中，植酸占到土壤總磷的20%以上，每年在土壤中積累的植酸可達(dá)5 100萬t，相當(dāng)于約65%的磷肥施用量。因此，如何釋放土壤中植酸的磷對(duì)于提高土壤有效磷具有重要意義。
可以水解植酸的酶有磷酸單酯酶、磷酸二酯酶和植酸酶，其中植酸酶可特異性高效催化植酸水解為肌醇和磷，進(jìn)而提高土壤中溶解性磷含量。根據(jù)來源不同，植酸酶主要分為細(xì)菌植酸酶和植物植酸酶2類。目前研究報(bào)道的產(chǎn)植酸酶細(xì)菌超過100種，主要分布于大腸桿菌、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、乳酸菌屬等；而植物植酸酶主要存在于種子(如小麥、玉米、大豆)中，用于種子萌發(fā)時(shí)釋放儲(chǔ)存的磷。植物植酸酶產(chǎn)量低、提取成本高，工業(yè)應(yīng)用較少，主要依賴細(xì)菌來源的植酸酶。值得一提的是，細(xì)菌植酸酶比植物植酸酶具有更強(qiáng)的水解活力，且無須復(fù)雜的蛋白修飾，因此更加適用于土壤有機(jī)磷分解研究。研究表明，植酸酶添加可提高土壤有效磷含量1.18倍，且明顯促進(jìn)水稻生長。雖然目前已挖掘了許多解磷菌，但其解磷機(jī)制主要依賴分泌有機(jī)酸釋放礦物中的無機(jī)磷，或通過磷酸酶水解結(jié)構(gòu)簡單的有機(jī)磷，通常對(duì)植酸的水解能力有限。利用微生物植酸酶構(gòu)建基因工程植物促生菌，可以有效彌補(bǔ)減少磷肥使用后的缺口，提高土壤有效磷含量。大腸桿菌植酸酶AppA具有高效催化活性與廣譜適應(yīng)性，在pH 2.0-7.5范圍內(nèi)均可高效水解植酸，同時(shí)耐受60-70℃高溫，此外AppA還展現(xiàn)出強(qiáng)抗逆性、易于異源表達(dá)，且在復(fù)雜基質(zhì)中保持高底物親和力，因此細(xì)菌植酸酶AppA是植酸活化研究的重要蛋白酶之一。
目前，植物促生菌在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，可在一定程度上替代部分傳統(tǒng)農(nóng)用化學(xué)品，提高糧食產(chǎn)量。然而，雖然從土壤中分離并馴化了一些植物促生菌，但這些促生菌的遺傳信息不明確，且通常進(jìn)化出與農(nóng)業(yè)種植不協(xié)調(diào)的遺傳調(diào)控模式，同時(shí)復(fù)雜的土壤環(huán)境也會(huì)干擾其促生作用，這極大限制了植物促生菌的實(shí)際應(yīng)用。相比之下，氮固定、磷釋放、纖維素分解、植物免疫誘導(dǎo)等相關(guān)的微生物促生機(jī)制和基因已被廣泛研究和報(bào)道，為開發(fā)農(nóng)業(yè)促產(chǎn)的基因工程菌提供了巨大潛力。隨著全球?qū)D(zhuǎn)基因技術(shù)的逐步放開和接受，為農(nóng)業(yè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)相匹配的土壤元素活化和植物促生工程菌將是未來趨勢(shì)之一。
向?qū)NA輔助的靶向轉(zhuǎn)座元件插入系統(tǒng)INTEGRATE(insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting)是2019年報(bào)道的一種優(yōu)秀的細(xì)菌基因編輯CRISPR工具，其可以實(shí)現(xiàn)長達(dá)10 kb堿基的準(zhǔn)確、高效、無標(biāo)記的基因組整合。這種可編程整合酶系統(tǒng)克服了現(xiàn)有整合子系統(tǒng)的一些重要弊端，例如效率低、依賴重組、需要多個(gè)載體輔助、靶點(diǎn)位置固定等。然而，該系統(tǒng)在功能基因移植以及通用編輯靶點(diǎn)挖掘等方面的研究較少。此外，另一種微生物技術(shù)是針對(duì)細(xì)菌膜蛋白的改造。細(xì)菌表面展示技術(shù)是一種對(duì)細(xì)菌細(xì)胞外膜蛋白的改造技術(shù)，通過將靶蛋白的N端或C端與錨定蛋白融合，進(jìn)而將感興趣的蛋白質(zhì)或酶直接固定在微生物細(xì)胞表面上，使目的蛋白定位于宿主細(xì)胞表面發(fā)揮功能，這一方面可以規(guī)避酶的裂解釋放過程，減少傳質(zhì)限制，同時(shí)可保證酶的活力以及穩(wěn)定性。相關(guān)研究表明，表面展示后的蛋白酶可以提高其在土壤環(huán)境中的穩(wěn)定性，并延長其作用時(shí)間，進(jìn)而充分發(fā)揮酶在環(huán)境中的作用。
基因修飾是指通過生物技術(shù)手段人為改變生物體的基因組，包括插入、刪除或修改特定基因，以改變其性狀或功能。本研究針對(duì)黑土中植酸的水解，提出了基于INTEGRATE靶向轉(zhuǎn)座技術(shù)，利用細(xì)菌植酸酶基因appA對(duì)土著微生物進(jìn)行基因插入修飾，并通過表面展示技術(shù)進(jìn)一步發(fā)揮植酸酶的作用，旨在實(shí)現(xiàn)水解黑土植酸并提高有效磷含量。其中，該研究的關(guān)鍵技術(shù)包括INTEGRATE轉(zhuǎn)座插入、表面展示的融合蛋白構(gòu)建、目的基因的功能表達(dá)等。本研究對(duì)構(gòu)建好的植酸酶基因修飾菌的酶活進(jìn)行檢測(cè)，并將其施用于黑土土壤，以期為黑土保護(hù)提供新的微生物策略，也為基因工程菌的構(gòu)建提供新的思路。
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