LSDV/Jiling/2022株接種后8 h滴度可達(dá)到102.5 TCID50·mL-1；接種96 h后，滴度最高，可達(dá)到105.3 TCID50·mL-1；接種120 h后，滴度開始下降，可達(dá)到105.1 TCID50·mL-1接種216 h后，滴度為103.5 TCID50·mL-1(如圖4b)。
LSDV/Jiangxi/2022株接種后8 h滴度可達(dá)到102.1 TCID50·mL-1；接種96 h后，滴度最高，可達(dá)到105.1 TCID50·mL-1；接種120 h后，滴度開始下降，可達(dá)到105.0 TCID50·mL-1接種216 h后，滴度為103.4 TCID50·mL-1(如圖4c)。
上述結(jié)果表明分離毒株LSDV/Heilongjiang/2022以及LSDV/Jiling/2022在前96 h的增長速度最快，到96~120 h時滴度最高，之后病毒生長速度開始減緩。
2.6分離毒株的GPCR基因測序及分析
測序結(jié)果表明，擴(kuò)增出的GPCR基因序列與GenBank中報道的LSDV毒株基因序列相似度為95.7%~100%之間。在NCBI數(shù)據(jù)庫下載92株可用的不同國家代表株以及國內(nèi)各地區(qū)毒株GPCR基因序列信息，同時下載SPPV和GTPV毒株序列各8株，包括國內(nèi)廣泛使用的山羊痘弱毒疫苗GTPV-AV41株，進(jìn)行GPCR基因遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果見圖5。
實心三角代表本試驗分離株
圖5 GPCR基因核苷酸遺傳進(jìn)化分析結(jié)果
由圖5可知，通過GPCR基因遺傳進(jìn)化分析可以將LSDV與GTPV、SPPV區(qū)分。LSDV被分為3個明顯不同的分支，LSDVⅠ包含多個疫苗毒株以及類疫苗樣毒株，親緣關(guān)系更近的LSDVⅡ-1與LSDVⅡ-2更多的為各地自然感染的分離毒株。所有中國毒株均被分類為LSDVⅡ-1亞群，這一亞群中已有多株病毒被確認(rèn)為重組病毒，值得注意的是我國分離毒株與越南、泰國毒株處于同一分支，且俄羅斯2020年以后的分離毒株也處于這一分支，提示這些毒株間有著更相似的病毒起源關(guān)系，推測這些毒株源于同一祖先，與印度和南非等地分離毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
序列比對結(jié)果顯示Nohar/2022、Jalore/2022、Anand/2022、IND/2022、South Africa NW LW(2006)存在12個堿基(1 045-1 056 nt)的缺失，而中國毒株并沒有發(fā)現(xiàn)這種缺失。相比于SPPV而言，LSDV與GPTV親緣關(guān)系更為相近，且GPTV與SPPV相比于LSDV都存在44個堿基的缺失。
3討論
牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒引起的牛結(jié)節(jié)性皮膚病是當(dāng)前養(yǎng)牛業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)之一。2019年8月我國首例LSD疫情暴發(fā)于鄰近哈薩克斯坦的新疆伊犁州，張敏敏等從患病動物身上采集皮膚組織樣本分離出LSDV/China/Xinjiang，并得到其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)與源自俄羅斯的LSDV/Russia/saratov高度同源，推測我國LSD疫情為鄰國傳入，但是該毒株具有在LSDV Russia Khabarovsk 2020中未觀察到的新進(jìn)化特征，我國LSD暴發(fā)的LSDV分離株的真正來源仍需進(jìn)一步調(diào)查。自2020年以來，我國多個省份密集發(fā)生了多起LSD疫情，至今已經(jīng)波及十余個省份。2017年俄羅斯地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)LSDV重組毒株，周秀蓉等對2020年2份華南地區(qū)牛結(jié)節(jié)組織樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)GD01和GX02株均屬于重組病毒，且進(jìn)一步確定2020年中國香港、中國臺灣和越南的LSDV分離株均屬于重組毒株。在LSDV疫情暴發(fā)的地區(qū)，農(nóng)民和相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)者不僅面臨著嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還需應(yīng)對該疾病對牛群健康和生產(chǎn)力產(chǎn)生的威脅。此外，LSDV的傳播媒介主要為吸血節(jié)肢動物，這為疫情的防控增加了難度。因此，對LSDV的進(jìn)行深入了解，進(jìn)一步加強(qiáng)病毒學(xué)研究至關(guān)重要。
本研究采用WOAH推薦方法鑒定了來自黑龍江、吉林以及江西三地的病牛皮膚結(jié)節(jié)為LSDV陽性。痘病毒是一類最大的動物病毒，根據(jù)標(biāo)尺估算LSDV/Heilongjiang/2022株病毒平均大小約240 nm×280 nm、LSDV/Jiangxi/2022株病毒粒子平均大小約276 nm×245 nm符合一般的LSDV病毒粒子大小，LSDV/Jiling/2022株病毒粒子平均大小約210 nm×200 nm，略微偏小，可能是病毒生長時期不同，而電鏡拍攝病毒粒子過少導(dǎo)致的統(tǒng)計偏差。
GPCR是一類高度保守的膜蛋白，廣泛存在于動物、植物和微生物中，是聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)、外信號的重要橋梁，參與調(diào)控多種細(xì)胞生理過程。在病毒學(xué)中，一些病毒通過編碼GPCR樣受體來操縱宿主細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，以促進(jìn)其自身的復(fù)制和傳播。LSDV的GPCR基因尚未被廣泛研究，Le Goff等認(rèn)為GPCR基因與病毒宿主相關(guān)，但其確切功能尚不清楚。
本研究測得三株病毒GPCR基因序列，并與包括GPTV、SPPV代表毒株各8株、中國目前已上傳NCBI的各省份毒株以及部分其他國家分離毒株對核苷酸進(jìn)行比對及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，本研究分離的3株LSDV毒株GPCR基因與國內(nèi)外其他報道中的LSDV毒株基因序列相似度為95.7%~100%，中國各地區(qū)分離毒株以及鄰國越南、泰國分離毒株遺傳關(guān)系近，位于一個相對獨立的分支LSDVⅡ-1中，這一分支中的毒株來源國家在地理位置上與中國接壤或集中于中國周邊地區(qū)，與印度以及南非分離的毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與牛及其副產(chǎn)品的國際多邊貿(mào)易有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與Ren等的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實我國流行的病毒株逐漸形成一個新的流行毒株群。LSDV幾乎同一時間傳入中國和越南，而后傳入泰國，這三國內(nèi)部LSDV傳播軌跡仍然是一個謎。本研究對了解國內(nèi)LSDV流行毒株的遺傳演化、流行病學(xué)調(diào)查和防控具有借鑒意義。但為了更深入地了解LSD疫情的確切傳播和進(jìn)化軌跡，我們需要進(jìn)行更多的流行病學(xué)調(diào)查。
LSD的防控涉及多方面的策略。首要措施是通過疫苗接種提高牛的免疫力，減輕感染的程度，并防止疾病的傳播，目前已有多篇文章報道其他國家使用減毒活疫苗失敗的案例，因此我們對其安全性和有效性存疑。當(dāng)前國內(nèi)用于防治LSDV的疫苗主要為山羊痘疫苗，牛結(jié)節(jié)性皮膚病滅活疫苗也已通過審批并正式上市銷售。對我國更多LSDV毒株的分離以及基因測序有助于了解LSDV在我國流行毒株的分子生物學(xué)特征，有助于疫苗的研發(fā)工作。了解病毒的傳播途徑、潛伏期、宿主免疫機(jī)制等方面的信息，有助于制定更為精準(zhǔn)的防控策略。此外，國際合作也是重要的一環(huán)，分享疫苗技術(shù)、疫情信息以及經(jīng)驗教訓(xùn)，可以更好地應(yīng)對LSDV的流行。
4結(jié)論
本研究從黑龍江、吉林及江西三省患病牛皮膚結(jié)節(jié)中分離出3株LSDV，通過PCR檢測、病變觀察、TCID50測定、電鏡觀察、免疫熒光鑒定、生長曲線測定等方法，對3個分離毒株進(jìn)行了詳細(xì)研究。對GPCR基因測序及分析結(jié)果表明，3株分離毒株與國內(nèi)外其他報道中的LSDV毒株基因序列相似度為95.7%~100%之間，我國流行的LSDV毒株處于相對獨立的進(jìn)化分支。