1.3.2細(xì)菌16S rDNA鑒定
采用DNA提取試劑盒提取腐敗菌的DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的V 3區(qū)進(jìn)行P C R擴(kuò)增。5 0μL P C R擴(kuò)增體系：2×Taq Master Mix 25μL，DNA模板1μL，引物（10μmol/L）各1.5μL，ddH2O 21μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將條帶清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)www.NCBI.nlm.gov./blast網(wǎng)站進(jìn)行序列同源性比對(duì)。
1.3.3 PCR-DGGE分析
1.3.3.1微生物總基因組DNA提取
樣品處理同1.3.1節(jié)，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取4℃貯藏6 d調(diào)理牛排的總DNA。
1.3.3.2 PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增采用帶GC夾子的特異性引物U968-GC（CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V6～V8區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq Master Mix 12.5μL，DNA模板1μL，引物（10μmol/L）各1.5μL，ddH2O 8.5μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。
1.3.3.3 DGGE
使用8%聚丙烯酰胺凝膠，采用40%～60%的變性膠。將灌好膠的玻璃板放入電泳槽內(nèi)升溫至60℃，130 V預(yù)跑膠20 min。點(diǎn)樣20μL，200 V、90 mA高壓預(yù)跑膠10 min后，85 V、50 mA恒壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后，將變性膠放入50 mL 1×TAE電泳緩沖液（含5μL Gel-Green DNA染色劑）染色30 min。用ddH2O漂洗2～3次后用化學(xué)發(fā)光儀系統(tǒng)拍照。
1.3.3.4 DGGE條帶回收與測(cè)序
將變性膠置于紫外條件下，用無(wú)菌手術(shù)刀切下各泳道的主要條帶，溶于盛有20μL TE緩沖液的PE管中，4℃過(guò)夜提取DNA。以回收的DNA為模板，以U968（AACGCGAAGAACCTTAC）（無(wú)GC夾子）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）為引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和條件同1.3.3.2節(jié)。
1.3.4 CEO、CSEO、BPEO抑菌性能測(cè)定
1.3.4.1抑菌圈直徑
將優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)制成106 CFU/mL的菌懸液，置于4℃冰箱備用。用無(wú)菌棉簽蘸取菌液，在培養(yǎng)基上劃線涂布。將6 mm的無(wú)菌空白藥敏紙片放置于培養(yǎng)基上，分別滴加10μL CEO、CSEO、BPEO，每皿4片，以無(wú)菌生理鹽水為空白對(duì)照。在4℃冰箱中放置4 h，使精油在含菌平板上自紙片中心向外圍擴(kuò)散，隨后放入各溫度培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌作用判斷：抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感；10～20 mm為中度敏感；6～10 mm為低度敏感；＜6 mm為無(wú)抑菌作用。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)均有抑菌作用的結(jié)果判為合格。
1.3.4.2最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrate，M I C）和最小殺菌濃度（m i n i m u m b a c t e r i c i d a l concentrate，MBC）
采用二倍稀釋法測(cè)定精油的MIC與MBC。分別吸取一定量的CEO、CSEO、BPEO，加入1%（V/V）吐溫-80無(wú)菌水溶液，使其體積濃度為64μL/mL。吸取1 mL上述植物精油溶液，加入LB培養(yǎng)基，將其體積濃度依次稀釋為32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5μL/mL，最后一管移取1 mL植物精油溶液。每個(gè)試管中加入等體積的菌懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，若溶液呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，對(duì)應(yīng)的植物精油體積濃度則為MIC。蘸取澄清試管中的溶液劃線，24 h未長(zhǎng)菌的植物精油體積濃度即為MBC。
1.3.4.3細(xì)菌生長(zhǎng)曲線
各精油的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線通過(guò)光密度測(cè)定，吸取一定量的植物精油和菌懸液置于酶標(biāo)板，使精油體積濃度分別為MIC和2MIC，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 h取出測(cè)定OD600 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，每次設(shè)置3個(gè)平行，記錄并繪制生長(zhǎng)曲線。
1.4數(shù)據(jù)處理
使用IBM SPSS Statistics 26.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并以Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性（以P＜0.05為差異顯著）標(biāo)記。
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