1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1菌株初篩
首先對(duì)葡萄球菌進(jìn)行安全性篩選。
溶血實(shí)驗(yàn)：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種于血平板上，37℃培養(yǎng)24 h，篩選無(wú)溶血圈的菌株。
凝固酶實(shí)驗(yàn)：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種到兔血漿中，37℃培養(yǎng)24 h，篩選無(wú)凝固酶的菌株。
DNA酶實(shí)驗(yàn)：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種于平板上，37℃培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)基表面滴加1 mol/L鹽酸，篩選無(wú)透明環(huán)的菌株。
藥敏性實(shí)驗(yàn)：將菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，將藥敏紙片放在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，篩選無(wú)耐藥性的菌株。
將篩選出的葡萄球菌和乳酸菌進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
產(chǎn)黏實(shí)驗(yàn)：挑取單菌落進(jìn)行觀察，篩選不產(chǎn)黏的菌株。
發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：滴加細(xì)菌培養(yǎng)物于葡萄糖產(chǎn)氣生化管中，37℃培養(yǎng)24 h，變黃者為陽(yáng)性，無(wú)變化者為陰性，篩選產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的菌株。
產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)：將質(zhì)控菌液加入乙酰胺肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，滴加鈉氏試劑3～5滴。呈磚紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性，篩選不產(chǎn)氨的菌株。
產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)：滴加細(xì)菌培養(yǎng)物于硫化氫生化管中，37℃培養(yǎng)24 h，變黑者為陽(yáng)性，無(wú)變化者為陰性，篩選不產(chǎn)H2S的菌株。
過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：滴加3%(體積分?jǐn)?shù))的H2O2溶液于細(xì)菌培養(yǎng)物的試管中，產(chǎn)氣泡為陽(yáng)性，反之為陰性。
氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)：37℃培養(yǎng)接種物24 h，呈紫色者為氨基酸脫羧酶試陽(yáng)性，呈黃色為陰性，同時(shí)做氨基酸脫羧酶對(duì)照試驗(yàn)，篩選無(wú)氨基酸脫羧酶的菌株。
1.2.2菌株復(fù)篩
硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基中，陰性仍為紫色，陽(yáng)性則變成磚紅色，篩選硝酸鹽還原酶陽(yáng)性菌株。
蛋白酶和脂肪酶水解實(shí)驗(yàn)：蛋白酶和脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)參考趙俊仁等的方法進(jìn)行測(cè)定。
抑菌試驗(yàn)：將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌涂布在MRS培養(yǎng)基上，打孔器打孔，加入50μL乳酸菌離心上清液，37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小。
拮抗實(shí)驗(yàn)：在平板上進(jìn)行十字交叉劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。
1.2.3優(yōu)良菌株的生物學(xué)特性
生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力：參考潘曉倩等的方法測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力。
葡萄球菌耐酸性測(cè)定：將菌株分別接種到pH值為4、5、6、7、8、9的NB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)其OD600值。
菌株耐鹽性測(cè)定：將菌株分別接種到含0%、2%、4%、6%、8%、10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的MRS、NB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)其OD600值。
菌株耐亞硝酸鹽性測(cè)定：將菌株接種到含0、50、100、150 mg/kg NaNO2的MRS、NB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)其OD600值。
1.2.4優(yōu)良菌株的鑒定
形態(tài)學(xué)鑒定：觀察培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)，包括形狀、大小、顏色等。
16S rDNA鑒定：采用PCR擴(kuò)增方法，送至江蘇金唯智有限公司測(cè)序，將測(cè)序序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比分析。
1.2.5統(tǒng)計(jì)分析
每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次平行，用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，MEGA 7.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
2結(jié)果與分析
2.1菌株篩選結(jié)果
從鲊肉粉中共分離純化出52株葡萄球菌和62株乳酸菌。首先對(duì)葡萄球菌進(jìn)行安全性檢測(cè)，其中溶血陰性、血漿凝固酶陰性、DNA酶陰性、不具耐藥性的葡萄球菌36株。按照肉制品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)葡萄球菌和乳酸菌做一系列篩選實(shí)驗(yàn)，篩選出不產(chǎn)黏、不產(chǎn)H2S、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、氨基酸脫羧酶陰性、硝酸鹽還原酶陽(yáng)性的菌株，最終得到2株產(chǎn)細(xì)菌素、抑菌效果好的乳酸菌菌株，2株具有蛋白酶和脂肪酶活力的葡萄球菌菌株，篩選得到的4株菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
表1篩選葡萄球菌菌體形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
葡萄球菌的脂肪酶和蛋白酶活性有助于發(fā)酵肉制品特殊風(fēng)味的形成；發(fā)酵肉制品中的乳酸菌需要無(wú)脂肪酶和蛋白酶活性，如果其具有蛋白質(zhì)降解活性，則可能縮短產(chǎn)品的貨架期，產(chǎn)生腐敗現(xiàn)象，而具有脂肪降解活性的乳酸菌會(huì)使產(chǎn)品在儲(chǔ)存銷(xiāo)售過(guò)程中出現(xiàn)酸敗味。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S6、S7、A1、C7之間無(wú)拮抗作用，可作為鲊肉粉發(fā)酵菌株使用，將葡萄球菌與乳酸菌復(fù)配制成復(fù)合發(fā)酵劑，來(lái)彌補(bǔ)單一菌種發(fā)酵的不足。
相關(guān)新聞推薦
1、?人類(lèi)胃腸道/人類(lèi)泌尿生殖道樣本采集
2、鐵載體和鐵離子對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程的影響