摘要：從黃河三角洲鹽堿地土壤分離到一株耐高鹽菌株NM-1.對(duì)該菌株生理生化性質(zhì)、耐鹽性以及系統(tǒng)分類位置進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：菌株NM-1為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏陰性，菌落黃色，呈圓形，濕潤(rùn)、光滑。能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，不能利用淀粉和明膠。生長(zhǎng)pH范圍為8.0——10.0,最高耐鹽濃度（NaCl）為30%,為中度嗜鹽微生物，最適生長(zhǎng)的Na2CO3濃度為0.25 M.16S rDNA序列分析表明：該菌株與Halomonas variabilis（JN645866）以及Halomonas variabilis（AY204638）序列的相似性均為98%,結(jié)合其形態(tài)、生理生化性質(zhì)，認(rèn)定該菌株屬于耐鹽單胞菌屬，暫命名為Halomonas sp.NM-1（AB917466）。
我國(guó)北方如黃河三角洲以及內(nèi)蒙古等地廣泛分布著大面積的鹽堿地，在這些高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物群體由于長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境，逐漸形成了極為特殊的耐鹽機(jī)制，具有很高的研究和利用價(jià)值。
目前，已發(fā)現(xiàn)的中度嗜鹽菌多為鹽單胞菌屬（Halomonas）的革蘭氏陰性菌、好氣桿菌。該屬是1980年Vreeland等鑒定出伸長(zhǎng)鹽單胞菌（Halomonaselongate）時(shí)首次提出的。也有其他科的好氧或兼性厭氧菌，包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、產(chǎn)甲烷菌和嚴(yán)格厭氧細(xì)菌。耐鹽單胞菌是一類能在絕對(duì)鹽度（NaCl）為0%——32%條件下生長(zhǎng)的耐鹽細(xì)菌。目前報(bào)道的鹽單胞菌屬細(xì)菌都生長(zhǎng)在高鹽環(huán)境，如鹽場(chǎng)和鹽湖、鹽水濕地、鹽漬土、海水、海生生物、深海熱液噴口、鹽堿地。
作者從黃河三角洲鹽堿地土壤中分離一株高耐鹽菌，對(duì)其形態(tài)、生理生化性質(zhì)、耐鹽能力以及16S rDNA基因序列進(jìn)行了解析，以期為開(kāi)發(fā)和利用耐鹽菌種資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試樣及培養(yǎng)基
土壤樣品采集于黃河三角洲鹽堿地，共選取11個(gè)采樣點(diǎn)，將各點(diǎn)表層（3——30 cm）土壤采集后混勻，立即裝入滅菌的密封袋中，土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后立即對(duì)菌進(jìn)行富集和分離。剩余樣品儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用。
富集培養(yǎng)基成分：（NH4）2SO41 g,K2HPO47 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,葡萄糖10 g,蒸餾水1000 mL.分離培養(yǎng)基成分：酵母膏10 g,蛋白胨7.5 g,檸檬酸鈉3.0 g,KCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.036 g,NaCl 20.0 g,Na2CO310.0 g,蒸餾水1000 mL,pH用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。富集培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min后使用，制備固體平板培養(yǎng)基時(shí)加入15 g·L-1瓊脂，制備半固體培養(yǎng)基時(shí)加入2 g·L-1瓊脂。
1.2耐鹽細(xì)菌的富集、分離和篩選
稱量5 g土樣加入盛有45 mL無(wú)菌水的燒杯中，攪拌，使土壤溶解，靜置20 min,取土壤浸出液10 mL加入盛有200 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6 d（130 r·min-1,30℃），取3 mL上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)3次，培養(yǎng)條件同上，得到耐鹽堿細(xì)菌富集液。
1.3生理生化性質(zhì)測(cè)定
對(duì)上述純化得到的單菌落用耐鹽菌富集液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液，對(duì)其生理生化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括革蘭氏染色、MR實(shí)驗(yàn)、V.P實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、H2O2酶測(cè)定，操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn).
1.4不同pH對(duì)耐鹽堿菌生長(zhǎng)的影響
所用培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基。用NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為8、9、10、11和12.分裝150 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min,冷卻，然后接種1.5 mL富集培養(yǎng)液（109cfu·mL-1）。培養(yǎng)條件為恒溫振蕩培養(yǎng)（130 r·min-1,30℃），每隔24 h定期取培養(yǎng)液，測(cè)定其吸光度（OD），波長(zhǎng)采用560 nm,平行測(cè)定3個(gè)重復(fù)。
1.5不同NaCl濃度對(duì)菌生長(zhǎng)的影響
向富集培養(yǎng)基中加入NaCl,分別配制成含10%、20%和30%的NaCl溶液，調(diào)整pH為9.0,接種、培養(yǎng)以及吸光度測(cè)定均同1.4,平行測(cè)定3個(gè)重復(fù)。
1.6不同Na2CO3濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
向富集培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的Na2CO3,使Na2CO3濃度分別為0、0.2、0.25、0.3 M,121℃滅菌20 min,接種富集培養(yǎng)液并定期測(cè)定菌液吸光度OD560,培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同1.4,平行做3個(gè)重復(fù)。
1.7耐鹽菌DNA的提取、PCR反應(yīng)及系統(tǒng)樹(shù)的創(chuàng)建
1.7.1細(xì)菌DNA提取
采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）對(duì)菌株進(jìn)行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.7.2引物
采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：7F:5‘-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;1540R:5‘-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.
1.7.3PCR反應(yīng)條件
1.7.4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的創(chuàng)建及分類學(xué)位置的確定
利用DDBJ（DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)，把分離菌株測(cè)得的16S rDNA序列進(jìn)行序列比較，與相似度高的16S rDNA序列創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，所用軟件為CustalX2.1和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣根據(jù)Kimura模型估算，創(chuàng)建方法為鄰接法（Neighbor-Joining）。
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