1.4煙草青枯病菌對(duì)不同藥劑的敏感性測(cè)定
采用生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)定煙草青枯病菌對(duì)氟啶胺、雙苯菌胺、噻霉酮、鏈霉素和春雷霉素的藥劑敏感性。從煙草青枯病菌劃線平板上挑取單菌落加入NA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)19 h，備用。將藥劑按照體積比1∶100加NA液體培養(yǎng)基中，藥劑濃度見表1。氟啶胺、雙苯菌胺和噻霉酮以只加二甲基亞砜的NA培養(yǎng)液為對(duì)照，鏈霉素和春雷霉素以只加無(wú)菌水的NA培養(yǎng)液為對(duì)照。加樣板每孔加入不同濃度藥液3μL、營(yíng)養(yǎng)肉湯250μL、青枯菌菌液50μL，每個(gè)濃度重復(fù)3次。加樣板置入生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀上，于28~30℃、每隔30 min測(cè)定1次OD值。藥劑對(duì)青枯病菌的生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：
表1不同殺菌劑單劑及復(fù)配藥劑的濃度
以藥劑濃度的對(duì)數(shù)為x軸，抑制率的機(jī)率值為y軸，根據(jù)兩者間的線性關(guān)系，建立毒力回歸曲線方程y=ax+b，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r和藥劑對(duì)病原菌的有效抑制中濃度EC50。根據(jù)煙草青枯病菌敏感性的分布情況，建立青枯病菌對(duì)5種藥劑的敏感基線。
1.5復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力測(cè)定
在單劑毒力測(cè)定的基礎(chǔ)上，按氟啶胺分別與3種納米農(nóng)藥按體積比80∶1、40∶1、20∶1、4∶1、1∶1、1∶4、1∶20、1∶40和1∶80共9個(gè)配比測(cè)定其對(duì)煙草青枯病菌的抑制率，復(fù)配藥劑的終濃度見表1。采用Wadley方法對(duì)復(fù)配制劑進(jìn)行聯(lián)合作用評(píng)價(jià)，計(jì)算公式：
式中：a、b分別為氟啶胺與納米農(nóng)藥的復(fù)配比例，%；EC50（a）為氟啶胺的有效抑制中濃度，μg/mL；EC50（b）為納米農(nóng)藥的有效抑制中濃度，μg/mL。
式中：EC50（th）為混劑的理論有效抑制中濃度，μg/mL；EC50（ob）為混劑的實(shí)測(cè)有效抑制中濃度，μg/mL。
SR≤0.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有拮抗作用；SR在0.5~1.5時(shí)，表明兩種藥劑復(fù)配具有相加作用；SR≥1.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有增效作用。
2結(jié)果與討論
2.1煙草青枯病菌的分離鑒定
從江西省宜黃、黎川、樂(lè)安、廣昌、資溪和南豐等地區(qū)采集了煙草青枯病病樣，分離培養(yǎng)后青枯病菌在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落表面光滑，呈不規(guī)則圓形，不透明、黏稠狀且有流動(dòng)性，見圖1。將分離到的菌株采用煙草青枯病菌特異引物759/760進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果（圖2）表明，共有40株菌株基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)在預(yù)期位置（281 bp）。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTN比對(duì)，確認(rèn)分離菌株為煙草青枯病菌。分離的煙草青枯病菌地理來(lái)源為崇仁縣相山鎮(zhèn)2株；黎川縣4株，來(lái)自德勝鄉(xiāng)、湖坊鄉(xiāng)和潭溪鄉(xiāng)；宜黃縣5株，分別來(lái)自黃陂鎮(zhèn)和二都鎮(zhèn)；廣昌縣9株，來(lái)自頭陂鎮(zhèn)、旴江鎮(zhèn)和長(zhǎng)橋鄉(xiāng)；南豐縣10株，來(lái)自傅坊鄉(xiāng)、太和鎮(zhèn)和太源鄉(xiāng)；資溪縣2株，來(lái)自高阜鎮(zhèn)；樂(lè)安縣8株，來(lái)自招攜鎮(zhèn)和增田鎮(zhèn)，見表2。
圖1煙草青枯病菌在NA平板上的菌落形態(tài)
圖2煙草青枯病菌的PCR鑒定電泳圖
M.DL5000 Marker 2~40.煙草青枯病菌菌株編號(hào)（表2）
表2煙草青枯病菌菌株信息
2.2煙草青枯病菌生長(zhǎng)曲線
選取4株煙草青枯病菌，在生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀上連續(xù)培養(yǎng)65 h，監(jiān)測(cè)煙草青枯病菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，并繪制煙草青枯菌的生長(zhǎng)曲線。由圖3可知，培養(yǎng)4~19 h時(shí)煙草青枯菌快速生長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，19~38 h煙草青枯病菌的生長(zhǎng)相對(duì)平穩(wěn)，38 h后煙草青枯病菌開始逐漸衰亡。因此，在藥劑毒力試驗(yàn)中，選定培養(yǎng)19 h左右的菌液，此時(shí)菌株生長(zhǎng)活力較高，菌液OD600值代表煙草青枯病菌的生長(zhǎng)量，可通過(guò)OD值來(lái)比較藥劑處理對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響。
圖3煙草青枯病菌的生長(zhǎng)曲線
2.3煙草青枯病菌對(duì)氟啶胺的藥劑敏感性
氟啶胺和雙苯菌胺的作用機(jī)制為氧化磷酸化解偶聯(lián)。煙草青枯病菌對(duì)氟啶胺的藥劑敏感性（表3）表明，氟啶胺對(duì)供試菌株的EC50為0.147 1~0.890 4μg/mL，最大與最小的EC50之間相差6.05倍，平均EC50為0.305 0μg/mL，表明來(lái)自不同取樣地的煙草青枯病菌株對(duì)氟啶胺的敏感性差異不大。其中，EC50最低和最高的菌株均來(lái)自樂(lè)安，來(lái)自其他地區(qū)菌株的EC50居于兩者之間。煙草青枯病菌菌株對(duì)氟啶胺的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖4A），表明供試菌株對(duì)氟啶胺較敏感，可用于青枯病的防治。
表3煙草青枯病菌對(duì)不同藥劑的敏感性
圖4煙草青枯病菌對(duì)不同藥劑的敏感基線
2.4煙草青枯病菌對(duì)雙苯菌胺的藥劑敏感性
從表3可以看出，煙草青枯病菌對(duì)雙苯菌胺的敏感性較高，平均EC50為0.037 8μg/mL，且敏感性分布范圍相對(duì)較窄，最大和最小EC50分別為0.018 7μg/mL和0.053 4μg/mL，兩者僅相差2.86倍，分別來(lái)自黎川縣和廣昌縣。從敏感基線（圖4B）可以看出，煙草青枯病菌對(duì)雙苯菌胺的敏感性呈單峰曲線分布，表明供試菌株對(duì)雙苯菌胺敏感，未出現(xiàn)抗藥性菌株。
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