以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源分別培養(yǎng)玉米大斑病菌野生型和StSte12基因RNAi陽性轉(zhuǎn)化子，研究碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長和分生孢子發(fā)育的影響，為闡明StSte12基因的功能和病菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【z生長和分生孢子發(fā)育均有重要的調(diào)控作用，StSte12基因的表達(dá)量下降后，菌絲的生長勢變?nèi)酰伾儨\，生長速度顯著下降，產(chǎn)孢量顯著降低。4種供試碳源中，可溶性淀粉對StSte12基因調(diào)控菌絲生長和發(fā)育的影響最大，蔗糖最?。蝗樘菍tSte12基因調(diào)控分生孢子發(fā)育沒有顯著影響，而其他3種碳源的影響均達(dá)到顯著水平。
玉米大斑病是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)引起的玉米葉部病害，主要發(fā)生在氣候冷涼濕潤的地區(qū)，在嚴(yán)重流行年份減產(chǎn)可達(dá)50%以上。StSte12基因(S.turcicaSte12)屬于Ste12-like基因，與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)等真菌的Ste12-like基因有較高的同源性，其轉(zhuǎn)錄蛋白StSte12是Fus3/Kss1-homolog途徑(又稱Pathogenicity MAPK cascad)的主要轉(zhuǎn)錄因子，具有典型轉(zhuǎn)錄因子所特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；將StSte12基因在釀酒酵母ste12缺失突變體中表達(dá)時能夠恢復(fù)該酵母突變細(xì)胞缺失的生理特征。近期的研究表明，StSte12基因在玉米大斑病菌中調(diào)控附著胞發(fā)育，是病菌致病力形成的關(guān)鍵因子之一。但StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【L和孢子發(fā)育的調(diào)控作用，以及該調(diào)控作用是否受不同碳源的影響尚不明確。本研究擬以玉米大斑病菌StSte12基因的RNAi(RNA interference)陽性轉(zhuǎn)化子及其野生型菌株為試驗(yàn)材料，分析蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖4種碳源對菌絲生長、菌落形態(tài)和分生孢子發(fā)育的影響，闡明碳源對StSte12基因功能的影響，分析影響StSte12基因功能的可能營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝途徑，為深入研究玉米大斑病菌StSte12轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株玉米大斑病菌野生型菌株01-23(WT)和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子(StRNAi 3-6和StRNAi 9-10)，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。StRNAi 3-6和StRNAi 9-10的StSte12基因表達(dá)量分別為野生型菌株的38%和67%。
1.1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、去離子水1 000 mL。
1.1.3化學(xué)試劑葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。
1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)
分別用等量的供試碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，研究不同碳源對玉米大斑病菌野生型菌株及StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子(StRNAi)菌絲生長和孢子發(fā)育的影響，每個處理重復(fù)8次。供試培養(yǎng)基碳源為：葡糖糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖。
1.3試驗(yàn)方法
將在PDA平板培養(yǎng)基上25℃條件下生長7 d的試驗(yàn)菌株菌盤(直徑8 mm)接種于不同碳源培養(yǎng)基平板(直徑90 mm)的中心，25℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)8 d，每天測量菌落直徑，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、菌落直徑為縱坐標(biāo)繪制菌絲生長曲線，計(jì)算菌絲生長速率，菌絲生長速率(mm/d)=菌落直徑(mm)/培養(yǎng)時間(d)，取第4～8天菌絲生長速率的平均值作為各處理的平均菌絲生長速率(V)；以WT為對照，計(jì)算StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲生長抑制率(I)，I=(VWT-VStRNAi)/VWT×100%。觀察并記錄菌落形態(tài)和菌絲特征。收集培養(yǎng)8 d時的菌絲和分生孢子，顯微觀察菌絲和孢子形態(tài)，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)量。
1.4數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2013、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)處理與分析。
2結(jié)果與分析
2.1碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長速度的影響
由圖1可以看出，野生型菌株和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子在4種碳源培養(yǎng)基上均能生長，并且在8 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，一定程度上菌落直徑隨培養(yǎng)時間呈線性增加(R2>0.99)，在4種碳源培養(yǎng)基上StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的生長速度均低于野生型菌株01-23(圖1)。以野生型菌株為對照，計(jì)算StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲生長抑制率(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6的菌絲生長受抑制程度顯著高于StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10(P<0.05)，并且抑制程度受到碳源種類的顯著影響?？扇苄缘矸蹖D(zhuǎn)化子StRNAi 3-6的抑制率(31.4%)顯著高于其他3種碳源(平均26.5%)，而葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉等3種碳源對轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10的抑制率(平均14.1%)極顯著高于蔗糖(1.5%)。以蔗糖為碳源時，StRNAi 9-10的菌絲生長速率與野生型菌株01-23沒有顯著差異(P>0.05)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，StSte12基因的表達(dá)水平與菌絲生長速率有關(guān)，即StSte12基因調(diào)控著玉米大斑病菌菌絲的生長，但其調(diào)控作用受環(huán)境中的碳源種類影響，對于StSte12基因表達(dá)水平較低的轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6，不同碳源之間的影響差異顯著，而對于StSte12基因表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10，不同碳源之間的影響差異極顯著。4種碳源中，總體上可溶性淀粉的影響最強(qiáng)，蔗糖的影響最弱。
A.葡萄糖；B.乳糖；C.蔗糖；D.可溶性淀粉
圖1玉米大斑病菌野生型菌株和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌落生長曲線
A.葡萄糖,B.乳糖,C.蔗糖,D.可溶性淀粉；*表示P<0.05，**表示P<0.01
圖2碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長速度的影響
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