抗菌藥物PK/PD研究在新抗菌藥物的開發(fā)、臨床合理使用方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但這些PK/PD理論多數(shù)是基于最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)的數(shù)據(jù)做出的，如與療效最相關(guān)的PK/PD指數(shù)、靶值、達(dá)標(biāo)概率、折點(diǎn)等，均與MIC值有關(guān)。
MIC值是在系列固定濃度的固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的結(jié)果，是藥物的平均作用結(jié)果，不能反映藥物作用的時(shí)間過程。另外，MIC值的精度有限，這影響了基于MIC值的精確分析。
近年來，定量藥理學(xué)技術(shù)得到迅猛發(fā)展，其理論可以更好地指導(dǎo)抗菌藥物的研究。
本文是利用建模理論，用數(shù)學(xué)模型擬合西他沙星、莫西沙星、左氧氟沙星對金葡菌的體外殺菌曲線，求得關(guān)鍵的藥效動力學(xué)參數(shù)，以及與喹諾酮類藥物臨床效果最相關(guān)的PK/PD指數(shù)、PK/PD靶值，以反映藥物作用的情況，所獲得的結(jié)果與已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，探索體外PK/PD研究的價(jià)值。
1、材料和方法
1.1抗菌藥物和培養(yǎng)基
西他沙星：批號：080813，效價(jià)：92.9%，提供單位：天津漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司；莫西沙星：批號：091202，效價(jià)：95.7%，提供單位：杭州樣樣康生物技術(shù)有限公司；左氧氟沙星：批號：K-Y-L-H-M20090701，效價(jià)：86.4%，提供單位：浙江普洛康裕制藥有限公司。MH培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為35℃，孵育16~20h。
1.2實(shí)驗(yàn)菌株
金黃色葡萄球菌：07H071，為來自本單位臨床的分離菌。
1.3 MIC測定
采用標(biāo)準(zhǔn)平皿二倍稀釋法?？咕幬餃y定濃度范圍256~0.008mg/L。供試菌懸液用多點(diǎn)接種儀接種，每點(diǎn)接種量為104CFU。測定各抗菌藥物對各種致病菌的最低抑菌濃度。
1.4靜態(tài)殺菌曲線
在營養(yǎng)肉湯中加入一定濃度的待測抗菌藥物及菌應(yīng)用液，使培養(yǎng)液中細(xì)菌的終濃度在(1~5)×105CFU/mL左右(對照管中不含抗生素)。取即刻1、2、4、6、8、12及24h的培養(yǎng)物，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并繪制殺菌曲線。
1.5數(shù)學(xué)建模
細(xì)菌接種到生物體系中，在無藥物存在的情況下，細(xì)菌早期會按照指數(shù)的形式生長。隨著營養(yǎng)的消耗和菌體的增加，不再按照指數(shù)形式增長，逐漸進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。在此狀態(tài)下，體系會維持菌量在一定的水平。隨著時(shí)間的繼續(xù)延長，菌體的死亡速度超過生長速度，菌量會逐漸下降。
在實(shí)際試驗(yàn)中，因觀察時(shí)間有限，如常常觀察到24h，此時(shí)菌體達(dá)到平衡或從平衡處開始下降(死亡的速度大于生長的速度)。對菌體生長的描述，目前比較成功的方法是采用2室模型的方法進(jìn)行描述，其流程圖見圖1。
其假設(shè)接種的菌體分為敏感菌(S)和不敏感菌(P)，只有S菌具有生長的能力，生長系數(shù)為Ks，且S菌可以轉(zhuǎn)化成P菌，轉(zhuǎn)化速率常數(shù)為Ksp，同樣P菌也可以轉(zhuǎn)化成S菌，轉(zhuǎn)化系數(shù)為Kps，但一般認(rèn)為Kps為0。
另外S、P菌均按照同樣的速率死亡，其系數(shù)為Kd。藥物的作用被認(rèn)為是只作用在S菌?；谝陨夏Ｐ停梢詷?gòu)建如下的方程：
一定數(shù)量的細(xì)菌接種到體系中，細(xì)菌不是馬上進(jìn)入到對數(shù)生長階段，而是存在一個(gè)滯后現(xiàn)象。
在上述方程中，接種到體系的細(xì)菌，按照比例系數(shù)F值分成兩種狀態(tài)。對于體系中的藥物濃度C，假定實(shí)驗(yàn)期間保持恒定，這對目前實(shí)驗(yàn)的3種比較穩(wěn)定的抗菌藥物基本是符合的。
1.6數(shù)據(jù)分析
在無藥物存在的情況下，對空白對照組的細(xì)菌生長曲線進(jìn)行擬合，按照目標(biāo)函數(shù)最小的優(yōu)化方式，求得最佳的F、Nmax、Kd，并將此參數(shù)在隨后的擬合中，保持不變。將不同MIC值條件下的菌量變化和空白對照組再一同進(jìn)行擬合，求得各個(gè)參數(shù)。
所建立的方程(1)~(4)中，有代數(shù)方程和微分方程，無法通過常見的解微分方程組的方式進(jìn)行求解，本文采用了有解微分和代數(shù)方程能力的Matlab軟件(Release 2012a,MathWorks,Natick,MA,USA)進(jìn)行了數(shù)據(jù)計(jì)算，通過nlmefit()指令進(jìn)行非線性混合效應(yīng)的擬合。經(jīng)過多次迭代，求得方程中各種參數(shù)的最佳值。
根據(jù)所建立的模型，模擬不同藥物濃度情況下24h時(shí)體系中細(xì)菌的存量。將藥物濃度乘以時(shí)間除以MIC值，就可獲得AUC/MIC值，以該值和體系中細(xì)菌的量作圖，就可以觀察細(xì)菌計(jì)數(shù)隨著時(shí)間的變化規(guī)律，推測PK/PD的靶值。
1.7模型驗(yàn)證
采用常用的方法，如目標(biāo)函數(shù)值、測定值和擬合值的一致性情況進(jìn)行模型的驗(yàn)證。
2、研究結(jié)果
2.1靜態(tài)殺菌曲線
實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)菌株的MIC值，除了空白對照組外(Scinario 5)，還進(jìn)行了MIC為1、2、4、8h的藥物濃度殺菌曲線研究分別對應(yīng)Scinario 1~Scinario 4，對這些殺菌曲線的情況見圖2。
2.2模型參數(shù)和PK/PD靶值
目前所建立的模型可以模擬靜態(tài)情況下的殺菌曲線，擬合圖見圖2。在該圖中，所建立的模型，可以較好地?cái)M合3種藥物不同濃度下的殺菌曲線?；谀M曲線獲得的關(guān)鍵參數(shù)見表1。
表1中，反映藥物作用的EC50參數(shù)在3種藥物之間是有區(qū)別的，該值越小，殺菌活性越強(qiáng)。模擬的AUC/MIC與24h細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果見圖3。
圖3模擬的24h后體系中細(xì)菌菌落數(shù)與3種不同喹諾酮類藥物PK/PD指數(shù)-AUC/MIC的關(guān)系
從該圖中可以看出，細(xì)菌計(jì)數(shù)值(藥效學(xué))與AUC/MIC是直接相關(guān)的，即說明了這3個(gè)喹諾酮類藥物的PK/PD指數(shù)是AUC/MIC；另外，依據(jù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)不再下降的情況，很容易地計(jì)算出其PK/PD靶值，其值對3種藥物而言，均在50左右。
3、討論
以往主要用感染動物的PK/PD研究，來確定抗菌藥物PK/PD指數(shù)、PK/PD靶值，這些研究方法復(fù)雜、周期長，推廣困難。本文采用非線性混合效應(yīng)模型的原理，進(jìn)行了靜態(tài)體外殺菌曲線的擬合。
從獲得的結(jié)果看，所建立的模型能夠反映細(xì)菌的生長情況，由此獲得的關(guān)鍵的藥效學(xué)指標(biāo)，如Emax、EC50，可以用來進(jìn)行抗菌藥物作用效果的初步評價(jià)。
從本實(shí)驗(yàn)中，也可以進(jìn)行PK/PD指數(shù)、PK/PD靶值乃至給藥劑量的預(yù)測。在本文的結(jié)果中，3個(gè)不同藥物之間的Emax值基本相同，但EC50相差較大。
以EC50反映的活性中，西他沙星是莫西沙星的5倍，是左氧氟沙星的6.5倍，臨床劑量與體外活性的差別相一致。
在目前確定的臨床常用藥物劑量中，西他沙星為50mg，莫西沙星為400mg，左氧氟沙星為500mg。從模擬的AUC/MIC結(jié)果與細(xì)菌菌量的關(guān)系中可以看出，達(dá)到細(xì)菌計(jì)數(shù)不再下降的AUC/MIC值在50左右，且3種藥物之間差別很小。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的喹諾酮類藥物在抗革蘭陽性菌的研究中所獲得的靶值也是一致的。
以上結(jié)果說明，利用體外殺菌曲線結(jié)合建模和仿真技術(shù)，具有重要應(yīng)用價(jià)值，可以對抗菌藥物的PK/PD指數(shù)和靶值進(jìn)行預(yù)測。進(jìn)一步的研究，可以在該結(jié)果的基礎(chǔ)上展開；也可以對新的抗菌藥物進(jìn)行PK/PD初篩，增加臨床試驗(yàn)的成功率。
本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校幬餄舛仁前凑蘸愣ㄖ颠M(jìn)行計(jì)算，這與這3種藥物在溶液狀態(tài)下比較穩(wěn)定的情況是一致的。進(jìn)一步的模型優(yōu)化中，可以將藥物的降解因素考慮進(jìn)去。也可以模擬藥物濃度在體內(nèi)的變化，結(jié)合細(xì)菌的變化，建立動態(tài)體外PK/PD模型，從而獲得與臨床用藥更加一致的研究環(huán)境，其研究結(jié)果將更具指導(dǎo)意義。另外，也可以在一個(gè)濃度下，多次測試殺菌曲線，建立群體模型，加入實(shí)驗(yàn)變異的影響。
本實(shí)驗(yàn)作為一項(xiàng)探索性體外PK/PD研究，探討了殺菌曲線建模的可行性，以及其結(jié)果的預(yù)測能力。研究中，僅局限在一種臨床分離菌和3個(gè)同類作用機(jī)制藥物的比較研究。針對新的抗菌藥物，需要開展涵蓋更多臨床致病菌、多種給藥方式的全面研究。
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