四川酸菜主要是以芥菜為加工原料，通過優(yōu)勢菌群乳酸菌以厭氧為主發(fā)酵而成的一種發(fā)酵類食品[1]，是一種佐餐菜肴，也是一種輔料[2]。乳酸菌從來源上可分為動物源乳酸菌和植物源乳酸菌[3]，從發(fā)酵過程上可分為異型乳酸發(fā)酵菌和同型乳酸發(fā)酵菌[4]。乳酸菌能在酸性較強的條件下生長并能在鹽水濃度較高的環(huán)境中繁殖，但乳酸菌本身只有肽酶，合成氨基酸、核酸、維生素的能力極低，所以在乳酸菌的生長環(huán)境中需要加入氨基酸、維生素等生長因子[5]。楊靜等[6]研究得出植物乳桿菌在恒溫培養(yǎng)6 h～8 h后進入對數(shù)生長期，18 h后進入穩(wěn)定期。類干酪乳桿菌在4 h進入對數(shù)期，發(fā)酵30 h后進入穩(wěn)定期[7]。比較菌株的生長速率和產(chǎn)酸量可以反映乳酸菌的發(fā)酵性能[8]，羅強等[9]從自然發(fā)酵泡菜中篩選出9株產(chǎn)酸能力較強的菌株。乳酸菌可以分泌多種抑菌物質，主要包括有機酸、細菌素、過氧化氫等[10]。乳酸菌能夠產(chǎn)生有機酸，而有機酸的存在會導致環(huán)境pH值降低，進而抑制腐敗菌的生長[11]。郝湘妹[12]研究抑制霉菌乳酸菌的篩選、特性及應用時，發(fā)現(xiàn)pH值為中性的發(fā)酵上清液的抑菌活性顯著下降（p＜0.05）。
發(fā)酵菌株的產(chǎn)酸性能和抑菌性能對酸菜的風味有重要影響。從溫度和含鹽量兩個方面探究對菌株生長的影響，通過探究乳酸菌發(fā)酵液在32 h內的pH值變化規(guī)律篩選出產(chǎn)酸速率最快的菌株，采用牛津杯瓊脂擴散法對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌指示菌進行抑菌試驗，篩選出對不同指示菌抑制效果比較好的菌株，以期獲得理想的人工接種乳酸菌菌株，從而顯著縮短酸菜發(fā)酵周期，改善酸菜的品質[13-14]，為實現(xiàn)高品質規(guī)模化工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供菌種資源。
1材料與方法
1.1材料與試劑
目標菌（食品乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌菌株）：從自然發(fā)酵酸菜中分離所得；指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）：北京保藏生物科技有限公司。
MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.5 g、牛肉膏1.0 g、磷酸氫二鉀0.2 g、檸檬酸二銨0.2 g、乙酸鈉0.2g、葡萄糖2.0g、吐溫80 0.1mL、MnSO4·4H2O 0.025g、MgSO4·7H2O 0.058 g、蒸餾水100 mL，pH6.2～6.4[5]。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15 g～25 g、水1 000 mL、pH7.4～7.6。
LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15 g、pH7.0。
1.2儀器與設備
全自動生長曲線分析儀（BIOSCREEN C）
1.3方法
1.3.1生長趨勢的測定
選擇3種目標菌分別在MRS液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，并將2%的相應菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中。將菌液置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)52 h，每隔4 h測定1次菌液在600 nm處的吸光度，平行測定3次。
1.3.2培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響
以2%的接種量將菌液接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別在20、23、26、29、32、35、38℃培養(yǎng)24 h，并在600 nm處測定吸光度，平行測定3次[15]。
1.3.3含鹽量對菌株生長的影響
以2%的接種量將菌液接種于NaCl濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%和10%的MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并在600 nm處測定吸光度，平行測定3次[15]。
1.3.4乳酸菌的產(chǎn)酸性能測定
以2%的接種量將3株菌株接入到裝有2 mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中37℃培養(yǎng)0、8、16、24、32 h，分別測發(fā)酵液pH值，每株菌平行測定3次，結果取平均值[16]。
1.3.5乳酸菌的抑菌性能研究
指示菌以金黃色葡萄球菌為例，大腸桿菌和沙門氏菌試驗方法參照金黃色葡萄球菌。配制固體金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基，121℃滅菌15 min后取出倒平板，待凝固后于4℃保存?zhèn)溆谩?
金黃色葡萄球菌菌懸液的配制：將金黃色葡萄球菌接種于滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，放置在37℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出放入4℃冰箱備用。
將2%的食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌3株菌的發(fā)酵液接種培養(yǎng)24 h后于4℃，12 000 r/min離心10 min，取發(fā)酵上清液4℃保存?zhèn)溆?。?00μL稀釋后的指示菌液于相應的指示菌培養(yǎng)基上并均勻涂布在平板表面，輕輕放上牛津杯（牛津杯既不能集中放，也不能放在平板的邊緣，均勻放置）；用移液槍向牛津杯中加入100μL發(fā)酵上清液，對照用不加菌株的空白發(fā)酵液。放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察抑菌圈大小，用游標卡尺測量抑菌圈大小，每株菌平行測定3次，結果取平均值，比較3株菌的抑菌圈大小。
不同溫度和含鹽量下酸菜乳酸菌發(fā)酵液生長曲線變化（一）
不同溫度和含鹽量下酸菜乳酸菌發(fā)酵液生長曲線變化（二）