2 結(jié)果與分析
2.1 巴氏鏈球菌與肺炎鏈球菌纖維二糖利用基因簇的同源性比對
如圖1所示:以肺炎鏈球菌TIGR4兩個纖維二糖相關(guān)的基因簇為參考，在豬源巴氏鏈球菌WUSP067中也存在2個潛在的纖維二糖相關(guān)的基因簇，將這2個基因簇分別命名為CL1和CL2，即E8M05_RS02040—E8M05_RS02055和E8M05_RS06225—E8M05_RS06270。CL1和CL2都包含編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase systems，PTS)中的酶Ⅱ復(fù)合物和β-葡萄糖苷酶的基因。如圖1-A，CL1中包含4個基因，分別是LicTwp(編碼抗終止子蛋白)、BglP1wp(編碼PTS中酶ⅡC)、BglP2wp(編碼PTS中酶ⅡA)、BglAwp(編碼6-磷酸-β-葡萄糖苷酶)。CL2包含10個基因，其中有5個基因據(jù)報道與纖維二糖利用相關(guān)。如圖1-B所示，CL2包括celRwp(編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)、celAwp(編碼6-磷酸-β-葡萄糖苷酶)，以及celBwp、celCwp、celDwp(分別編碼PTS中酶ⅡC、酶ⅡB、酶ⅡA)，其余5個基因功能未知。在肺炎鏈球菌中，酶ⅡC特異性識別和捕獲纖維二糖，6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則負(fù)責(zé)將纖維二糖水解為單糖供細(xì)菌利用。
圖1 巴氏鏈球菌WUSP067與肺炎鏈球菌TIGR4纖維二糖利用相關(guān)蛋白氨基酸同源性比對
2.2 纖維二糖對巴氏鏈球菌纖維二糖利用相關(guān)基因表達(dá)的影響
從圖2可知，以添加10 g·L-1 Glu的DMEM培養(yǎng)基為對照組，在添加10 g·L-1 Cel的DMEM培養(yǎng)基中，celBwp和celAwp的基因表達(dá)量分別上調(diào)33倍和49倍(P<0.000 1)，而Bglp1wp和BglAwp表達(dá)量無顯著變化。此結(jié)果表明CL2在纖維二糖轉(zhuǎn)運和利用中發(fā)揮作用，故選擇CL2進(jìn)行深入研究。
圖2 纖維二糖對巴氏鏈球菌纖維二糖利用相關(guān)基因表達(dá)的影響
2.3 巴氏鏈球菌纖維二糖利用基因簇CL2結(jié)構(gòu)
使用引物1-1-F/R、1-2-F/R、1-3-F/R、1-4-F/R擴(kuò)增出長度分別為451、494、1 280 和350 bp的片段(圖3-A、B); 使用引物1-6-F/R和1-7-F/R擴(kuò)增出長度分別為501和439 bp的片段，而使用引物1-5F/R和1-8-F/R不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(圖3-C)。這表明CL2由2個操縱子組成，即E8M05_RS06225—E8M05_RS06255和E8M05_RS11050—E8M05_RS06270。
圖3 RT-PCR驗證CL2基因簇結(jié)構(gòu)
2.4 缺失株ΔcelAwp的構(gòu)建和鑒定
采用信號肽同源重組的方法構(gòu)建ΔcelAwp(圖4-A)。使用引物CelA-M/N，以缺失株ΔcelAwp為模板，擴(kuò)增出大小為1 262 bp片段，而以野生株為模板，擴(kuò)增出大小為1 928 bp片段; 使用引物CelA-X/Y，以缺失株ΔcelAwp為模板時，不能擴(kuò)增出相應(yīng)片段，而以野生株為模板時，可以擴(kuò)增出大小為747 bp的片段(圖4-B)。上述結(jié)果表明缺失株ΔcelAwp構(gòu)建成功。
圖4 缺失株ΔcelAwp PCR鑒定
2.5 celAwp對巴氏鏈球菌WUSP067生長的影響
如圖5-A所示，在10 mL THB液體培養(yǎng)基中，將WUSP067野生株和缺失株ΔcelAwp在37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)，每隔2 h測定D600值，結(jié)果表明缺失基因celAwp對WUSP067在THB中生長沒有影響。
如圖5-B和5-C所示:在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)條件下，缺失株生長情況與野生株一致; 在纖維二糖為唯一碳源的條件下，野生株能夠生長，而ΔcelAwp則表現(xiàn)出明顯的生長缺陷，生長12 h時D600低于0.5。以上結(jié)果表明，巴氏鏈球菌WUSP067能以纖維二糖為唯一碳源生長，celAwp基因參與纖維二糖的利用，缺失該基因影響巴氏鏈球菌對纖維二糖的吸收與利用。
圖5 WUSP067和ΔcelAwp在不同培養(yǎng)基條件下的生長曲線
2.6 celAwp對巴氏鏈球菌WUSP067毒力的影響
以ICR斷奶仔鼠為感染模型進(jìn)行WUSP067野生株和缺失株ΔcelAwp的毒力試驗。結(jié)果如圖6所示，攻毒劑量為每鼠3×108 CFU，攻毒后野生株攻毒小鼠3日內(nèi)全部死亡，缺失株ΔcelAwp攻毒小鼠死亡時間延后，14 d后存活率20%，與野生株相比差異顯著(P<0.05)。此結(jié)果表明，celAwp基因影響巴氏鏈球菌WUSP067的致病性，缺失該基因其毒力減弱。
圖6 小鼠存活曲線
3 討論
目前，在鏈球菌屬中，只有肺炎鏈球菌和變異鏈球菌中有纖維二糖利用基因簇的報道。在變異鏈球菌中僅有纖維二糖利用基因簇CL2，且未見其與致病性相關(guān)報道。豬源巴氏鏈球菌WUSP067中CL2與變異鏈球菌CL2各基因的覆蓋率在90%以上，氨基酸同源性為56%～90%。當(dāng)前，豬源巴氏鏈球菌全基因組序列僅有WUSP067(GenBank ID:NZ_CP039457.1)和WUSP074(GenBank ID:NZ_CP116958.1)2株菌，WUSP074也有纖維二糖利用基因簇CL1和CL2，其CL1與WUSP067的CL1覆蓋率和氨基酸同源性均為100%，其CL2與WUSP067的CL2覆蓋率90%，氨基酸同源性為56%～100%。
在肺炎鏈球菌中，纖維二糖轉(zhuǎn)運和利用的基因簇主要有2個，都包含編碼PTS中的酶Ⅱ復(fù)合物和6-磷酸-β葡萄糖苷酶的基因，前者負(fù)責(zé)纖維二糖的識別、磷酸化和轉(zhuǎn)運，后者則將磷酸化后的纖維二糖水解為單糖供細(xì)胞利用。它們在調(diào)控方式上分為2種:一種是通過抗轉(zhuǎn)錄終止子蛋白調(diào)控，纖維二糖存在時被激活，抑制轉(zhuǎn)錄終止子的形成從而促進(jìn)后續(xù)基因的表達(dá); 另一種則是通過轉(zhuǎn)錄激活子celR調(diào)控，celR被纖維二糖激活后結(jié)合在纖維二糖利用操縱子的啟動子區(qū)域，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，這種正調(diào)控方式也存在于變異鏈球菌和嗜熱桿菌中，而艱難梭菌中celR是作為轉(zhuǎn)錄抑制子直接結(jié)合在纖維二糖操縱子的啟動子區(qū)域來抑制基因的表達(dá)。本試驗通過同源性分析發(fā)現(xiàn)巴氏鏈球菌WUSP067中預(yù)測存在2個潛在的纖維二糖利用基因簇CL1和CL2，預(yù)測其調(diào)控方式分別與第1種和第2種類似。從本研究中發(fā)現(xiàn)，CL1中BglP1wp、BglAwp基因不能感應(yīng)纖維二糖，而CL2中的celBwp和celAwp基因能感應(yīng)纖維二糖，表達(dá)量上調(diào)極顯著，有助于巴氏鏈球菌WUSP067利用纖維二糖，表明CL2與纖維二糖利用相關(guān)。纖維二糖的利用與細(xì)菌的致病性相關(guān):肺炎克雷伯菌中缺失celB基因(編碼酶ⅡC)后在腸道定殖能力減弱; 肺炎鏈球菌中，缺失BglA3(編碼β-葡萄糖苷酶)導(dǎo)致該菌對小鼠的致病性減弱; 艱難梭菌中，celA(編碼酶ⅡB)突變株因無法在腸道中獲取纖維二糖而表現(xiàn)出定殖劣勢; 李斯特菌中，纖維二糖通過抑制毒力基因激活子PrfA來抑制相關(guān)毒力基因的表達(dá)。本試驗結(jié)果表明，celAwp(編碼6-磷酸-β-葡萄糖苷酶)缺失后，巴氏鏈球菌在纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出明顯生長缺陷，說明celAwp在纖維二糖的利用中發(fā)揮重要作用，隨后通過小鼠致病性試驗明確celAwp是巴氏鏈球菌WUSP067的毒力因子。
目前，由于尚無巴氏鏈球菌互補株構(gòu)建方法，本試驗僅構(gòu)建了CL2基因簇中celAwp基因的缺失株，明確該基因與巴氏鏈球菌WUSP067纖維二糖的利用和其致病性相關(guān)，后續(xù)還應(yīng)對celAwp編碼的6-磷酸-β葡萄糖苷酶的酶活性進(jìn)行測定，進(jìn)一步明確其功能。巴氏鏈球菌可存在于豬的腸道中，故celAwp基因是否能通過利用纖維二糖促進(jìn)巴氏鏈球菌在腸道中的競爭優(yōu)勢，幫助該菌在腸道中定殖，從而增強(qiáng)其致病性有待后續(xù)深入研究。此外，關(guān)于CL2的調(diào)控方式及該基因簇中其他基因的功能也值得進(jìn)一步的探究。
綜上，本試驗結(jié)果明確豬源巴氏鏈球菌WUSP067能以纖維二糖為唯一碳源生長，CL2是纖維二糖利用相關(guān)基因簇，其中celAwp基因促進(jìn)該菌利用纖維二糖，對該菌生長和毒力有顯著影響，表明其在巴氏鏈球菌致病過程中發(fā)揮作用。
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